酵母双杂交的具体过程是什么？

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菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．

901 ，leu2—3
，112，ura3-52 ，his3-200
，gal4A，gal8O~X ，

LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-

ADE2
，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母

菌株(NATQ ，um3-52
，his3-200，ade2—101 ，trpl-901
，

leu2-3，112 ，g △
，met， O△ ，URA3：：GAL1U^s-

GAL1T^T^一laeZ
，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋

白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合

蛋白的阳性对照质粒 。pcArrr7．T是编码SV40大T

抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融

合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自

CLONTECH公司
。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega

公司。

1．2 试剂鲑鱼精担体DNA ，酵母培养用的YPD

Medium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一Leu

DO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement 、一Leu／Trp／His

DO Supplement
、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等

均购自CLONTECH 。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul
。

fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma 。DMSO购自

AMRESCO
。硝酸纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购

自BBI 。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其

它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。

1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2

mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质

粒
。分别用小规模碱裂解法7 (AIK法)和QtarREP

Miniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分

光光度法测0D260／280
，并计算质粒DNA含量 。

1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册

建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提

取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109

酵母菌株中 ，将转化好的细胞按照1：10、1：100 、1：

10003种不同浓度稀释
，然后取100 铺于SD／

Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目

(cfu)
。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu

×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×

DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的

质粒量而非全部质粒总量)。

1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述

两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌

株 ，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—

53]
，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一

p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷

液体培养基中 ，旋涡振荡1 mira
，彻底打散菌团 。将1

IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中
。将

pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同

酵母操作手册 ，将转化好的细胞按照1：10
、1：100、1：

1000三种不同浓度稀释
，然后取100 铺于SD／一

Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目

(cfu)。按上述公式计算转化效率 。

1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和

pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和

YM187中 ，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出

克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放

置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离

心管中
，涡流震荡1 min，彻底打散菌团 ，3ocI= 、200rpm过夜培养(20—24 h)
。100 交配培养物铺于

SD／一 一Leu培养基平板
，200 交配培养物铺于

SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数

目：将交配产物按照1：10
、1：100、1：1000三种不同浓

度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板 。待长

出克隆后计数cfu
。计算二倍体细胞数目：cfu×悬

浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。

1．7 窖a1分析实验

1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109

[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性 ，挑

酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在

相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上
，3ocI=

倒置培养24小时 。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分

别为10 s 、30 s、1 rain
、2 rain ，30cI=放置10 mill
，置于浸

没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙

醇 、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．

gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下

进行观察 ，15 rain记录一次
，以后可每隔1 h记录一

次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母

菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果
。同时

没定液氮冷冻时间为1 min ，比较处于不同显色温度

(25℃
、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。

1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109

[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同

时以AH109[pCL1]为阳性对照
，AH109[pGBKT7—053

+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载

体对照，AH109为阴性对照 。AH109[pCL1]的稀释

倍数为3 ，其余的稀释倍数为1
。具体步骤参照酵母

操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／

(t×V×ODao)
，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀

释倍数 。

酵母双杂交法的原理：

典型的真核生物转录因子 ， 如GAL4 、GCN4
、等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)
。

前者可识别DNA上的特异序列
， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用 ， 启动它所调节的基因的转录。

扩展资料：

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用
， 具有高度敏感性 。主要是由于：

1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达
。

2 、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤 ，降低了信号强度。

3
、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强
， 后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定 。

4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大
。同时 ， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

在研究蛋白质的结构功能特点 、作用方式过程中
，有时还要通过突变
、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用 。针对实际工作中的这种需要,Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入
。URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

百度百科——酵母双杂交

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